概要

立命館大学生命科学部の松村浩由教授らの研究グループは、大阪大学大学院生命機能研究科の難波啓一特任教授（常勤）、藤田純三特任助教（常勤）、京都府立大学大学院生命環境科学研究科の田中俊一准教授らと共同で、細菌の細胞分裂装置の一部であるフィラメントおよび人工結合タンパク質により安定化されたフィラメントからなる二重らせんの詳細な構造をクライオ電子顕微鏡を用いて明らかにしました。

本研究では、細菌の細胞分裂装置の一部であるFtsZフィラメントの溶液構造をクライオ電子顕微鏡を用いて世界で初めて高分解能で明らかにしました。さらに、このFtsZに特異的に結合する小さな人工結合タンパク質（モノボディ）を取得し、クライオ電子顕微鏡とX線を用いた立体構造解析によりモノボディの結合様式を明らかにするとともに、モノボディによって安定化された2本のFtsZフィラメントからなる二重らせん構造についても高分解能で構造決定に成功しました。FtsZは細菌の生存に必須であり、病原性細菌に対する抗菌薬のターゲットであるため、本研究により得られた知見は創薬への応用も期待されます。

研究の背景

黄色ブドウ球菌や肺炎桿菌等の細菌が引き起こす感染症、特に高齢者の院内感染は依然として世界的に大きな問題となっています。これらの感染症に対抗するための抗菌薬開発が進められてきましたが、従来使用されてきた抗菌薬に強い耐性を持つ薬剤耐性菌が出現したため、新しい作用機序を持つ抗菌薬の開発が望まれています。その中でも、FtsZというタンパク質は非常に多くの細菌に存在し、その生育に必須であることから創薬ターゲットとして注目されてきました。細胞分裂において、FtsZは細胞中心部でフィラメントを形成し、さらにフィラメントが束ねられてできたリングが収縮することで細胞分裂を進行させます（図1）。FtsZモノマーはGTPによりフィラメントの一方の端（＋端）で重合し、フィラメント中でGTPを加水分解した後にもう一方の端（－端）で解離しますが、この重合や解離の際にFtsZ自身の構造が変化すると考えられてきました。この構造変化を捉えるために、これまで多数のFtsZの分子構造がX線結晶構造解析により決定されてきましたが、この方法では結晶という分子が規則正しく高密度に並んだ状態での構造しか分からないため、より生体内の状態に近いと言われる溶液状態での構造解析が望まれてきました。2017年に初めてクライオ電子顕微鏡を用いた大腸菌由来FtsZフィラメントの溶液構造が報告されましたが（文献1）、その分解能は7〜8Å程度にとどまっていたため詳細な構造は不明でした。

本研究の成果

FtsZフィラメントは1分子が単純につながった構造をしており、その細さと柔軟性により分解能が伸びていませんでした。我々の研究グループは様々な細菌種のFtsZを試した結果、アミノ酸配列が大腸菌とよく似ていますがわずかに異なる肺炎桿菌由来FtsZが比較的安定なフィラメントを形成することを見出しました。クライオ電子顕微鏡や解析のためのソフトウェアの急激な進化も相まって、我々は肺炎桿菌由来FtsZフィラメントの溶液構造を世界で初めて3Åという高分解能で決定し（図2）、以前は見えていなかった詳細な構造を明らかにすることができました。特にFtsZに結合している低分子の結合様式がこれまでのどの構造とも異なっており、この変化がFtsZの機能に重要な役割を果たすのではないかと考えられます。 さらに、このFtsZに特異的に結合する小さな人工結合タンパク質モノボディを取得することにも成功しました。今回取得したモノボディは大腸菌由来FtsZおよび肺炎桿菌由来FtsZの両方に結合することができ、大腸菌の細胞分裂を阻害することも分かりました。このモノボディと肺炎桿菌由来FtsZを混合して結晶化し、X線結晶構造解析を行うことでモノボディがFtsZのどの部分に結合するのかも明らかになりました。

さらに我々は、電子顕微鏡での観察から肺炎桿菌由来FtsZはモノボディ結合時に太くて安定なチューブ状構造を形成することを見出しました。クライオ電子顕微鏡とEG-grid^TMという特殊なグリッドを用いた構造解析により、このチューブ状の構造を2.7Åという高分解能で決定することにも成功し、2本のFtsZフィラメントからなる二重らせん構造をとっていることを明らかにしました（図3）。また、モノボディについては2本のFtsZフィラメントの隙間を埋めるように結合しており、全体の構造を安定化していることも分かりました。モノボディがない場合でもより不安定ではあるものの似た構造をとるという結果も得られており、二重らせん構造あるいはその一部が生体内でも存在する可能性が示されました。

研究成果のポイント

• 細菌の細胞分裂装置の一部であるFtsZフィラメントの溶液構造をクライオ電子顕微鏡を用いて世界で初めて高分解能で明らかにした。
• FtsZに特異的に結合し、細胞分裂を阻害する小さな人工結合タンパク質（モノボディ）を取得し、X線結晶構造解析によりその結合様式を明らかにした。
• モノボディにより安定化されたFtsZフィラメントの二重らせん構造をクライオ電子顕微鏡を用いて高分解能で明らかにした。

本研究成果が社会に与える影響（本研究成果の意義）

本研究により得られた知見は細胞分裂という生命の根幹をなす現象の理解に繋がるだけでなく、創薬への応用も期待されます。また、モノボディを利用することで構造を安定化し、より高分解能での構造解析を可能とする戦略は他のタンパク質にも適用でき、クライオ電子顕微鏡による構造解析の幅をより一層広げることになります。今後はFtsZフィラメントに結合する他のタンパク質やモノボディとの複合体の構造解析を行うことで、細胞分裂の根底にある詳細なメカニズムに迫っていきたいと考えています。

特記事項

本研究成果は2023年7月11日（日本時間）、英国科学雑誌「Nature Communications」オンライン版に掲載されました。

本研究は、松村浩由教授、田中俊一准教授、藤田純三特任助教（常勤）に対する科学研究費補助金（JP18K05445, JP21K05386, JP18K06094, JP19H04735, JP20K22630）、田中俊一准教授らに対する公財日本科学協会笹川科学研究助成（2018-3011, 2022-4052）、難波啓一特任教授（常勤）らに対する科学技術振興機構（JST）産学共創プラットフォーム共同研究推進プログラム（OPERA: JPMJOP1861）、難波啓一特任教授（常勤）、松村浩由教授に対する日本医療研究開発機構（AMED）創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム（BINDS: JP21am0101117, JP22ama121003, JP21am0101070）、難波啓一特任教授（常勤）に対するAMED医療研究開発革新基盤創成事業（CiCLE: JP17pc0101020）、日本電子（JEOL）YOKOGUSHI協働研究所、松村浩由教授に対するG-7奨学財団、大阪大学蛋白質研究所拠点事業（共同研究員）（CR-20-02 and CR-21-02）などの支援の下で実施されました。