概要

大阪大学大学院生命機能研究科の林陽子特任助教（常勤）、平岡泰教授らの研究グループは、G1期の複製開始複合体MCM複合体の形成がヒストン修飾の変化によって制御されることを世界で初めて明らかにしました。

細胞が増殖するためには、DNAが複製される必要があります。DNAを複製する時期は、S期、その前の準備の期間は、G1期と呼ばれます。G1期は、細胞増殖のために複製期に進行するか、そのまま細胞周期の進行を停止するかを決める重要な時期です。MCM複合体はDNA複製を行う際にDNAのねじれを解く役割があり、S期の開始までには（つまり、G1期の終了までに）クロマチン上でMCM複合体の六量体単体（シングル）から六量体が2つ連結した状態（ダブル）に遷移することが知られていました。しかしながら、G1期の長い（〜数十時間）ヒト細胞において、どのような過程を経てダブル六量体が形成されるのかは不明でした。

今回、ヒト細胞ではG1期に進行したばかりの初期には、MCMはシングル六量体の状態にあり、S期が始まる3～4時間前（G1期後期）になって初めてダブル六量体を形成することが分かりました（図1）。また、この変化に先行して、ヒストンH4K20におけるヒストンメチル化修飾がモノメチル化からジ・トリメチル化への転換することが必須であることが分かりました。細胞周期の長い細胞では、MCMはシングル六量体の状態で留まることから、MCMの状態変化はDNA複製への進行過程を反映するものであり、細胞増殖の理解に繋がる重要な発見と言えます。

研究の背景

真核生物のDNA複製は、常に複製起点と呼ばれるDNA領域から開始されます。DNA複製が開始するためには、まず複製開始複合体が複製起点に結合する必要があります。

複製開始複合体の一因子MCM（シングル六量体）は、DNAに結合しねじれを解く働きがあると知られていました。DNA複製は両方向に向かって進行することから、2セットのMCM（ダブル六量体）が必要になります。しかしながらMCMが、どのようにダブル六量体を形成するかは明らかではありませんでした。

本研究の成果

研究グループでは、hTERT-RPE1細胞（不死化ヒト網膜色素上皮細胞）を用いて、シングルセルプロット解析法によりクロマチン画分に結合するMCM量が細胞周期の進行にともなってどのように変化するかを調べました（図2）。MCM量は、G1期初期では少～中程度だったのに対し、G1期後期になると多くなることが分かりました。

次に、G1期初期とG1期後期におけるMCM量の違いが何によるかを調べるために、ショ糖密度勾配法（図3）によって生化学的に調べました。その結果、G1期初期ではMCMはシングル六量体であり、G1期後期ではダブル六量体を形成することがわかりました。

細胞周期のフェーズがどの程度の長さかを複数の細胞で調べました（図4）。MCMのクロマチン結合量の多いG1期後期は3～4時間程度で、癌細胞のように増殖が盛んな細胞でも、正常細胞のように細胞周期が長い細胞でもほとんど変わりませんでした。つまり、一度クロマチンに結合するMCM量が多くなると3～4時間程度で複製期に移行することになります。一方で、MCM量が少～中程度のG1期初期は、癌細胞では7～8時間程度だったのに対し、細胞周期の長い細胞では数十時間にも及びました。この結果は、細胞周期の長さはG1期初期の長さに大きく影響を受けることを示唆していました。

さらに、このMCMがシングル六量体からダブル六量体を形成する前に、ヒストンH4K20me1がme2/me3になることがわかりました（図5）。ヒストンH4K20me2/me3への変化を阻害すると、MCMはダブル六量体を形成できずシングル六量体で留まることから、G1期の進行においてヒストンメチル化修飾がme1からme2/me3に変化することが必須であることになります。ヒストン修飾はエピジェネティクス制御に関わり遺伝子発現に関与することが報告されていますが、今回の結果から遺伝子発現だけでなく細胞周期のG1期の進行にも重要な働きを持つことが分かりました。

研究成果のポイント

• DNA複製開始に必要な複製開始複合体、MCM（ミニクロモソーム・メンテナンス）のダブル六量体形成にヒストン修飾が関与
• ヒト細胞では細胞周期G1期の進行に伴いMCM六量体がシングルからダブルの状態に変化
• 正常細胞ではMCMのシングル六量体の時間が長いが、ダブル六量体になると一定時間を経てDNA複製へ進行
• 癌細胞と正常細胞のMCMタンパク質の状態の違いから、癌細胞を標的とした創薬への応用に期待

本研究成果が社会に与える影響（本研究成果の意義）

本研究成果により、細胞周期、G1期の進行はヒストンメチル化修飾に依存することが分かりました。ヒストン修飾はエピジェネティクス制御に関わることから、遺伝子発現制御と細胞周期との関係が注目されます。また癌細胞と正常細胞の細胞周期の長さの違いはG1期初期の状態に依ることから、癌細胞を標的とした創薬への応用も期待されます。

研究者のコメント

初めてMCMタンパク質の免疫染色を行ってから、本論文を受理されるまでには長い時間がかかりました。その間、多くの方々に支えられて研究を続けることが出来たことに本当に感謝しております。研究に関する試薬などには公益財団法人浦上食品・食文化振興財団に、次世代シーケンス費には九州大学生体防御医学研究所「多階層生体防御システム研究拠点」の共同利用・共同研究に、また論文の英文校閲および投稿費に関しては大阪大学の研究推進部研究推進課研究プロジェクト推進係に本当にお世話になりました。どうもありがとうございました。（林陽子）

特記事項

本研究成果により、細胞周期、G1期の進行はヒストンメチル化修飾に依存することが分かりました。ヒストン修飾はエピジェネティクス制御に関わることから、遺伝子発現制御と細胞周期との関係が注目されます。また癌細胞と正常細胞の細胞周期の長さの違いはG1期初期の状態に依ることから、癌細胞を標的とした創薬への応用も期待されます。

本研究成果は、イギリス科学誌「Nucleic Acids Research」に、11月19日（金）9時（日本時間）に公開されました。

なお、本研究は、浦上食品・食文化振興財団（林陽子）、内藤記念科学振興財団（林陽子）、日本学術振興会科学研究費助成事業新学術領域研究「減数分裂における細胞核・クロマチン構造の変換メカニズム（研究代表者：平岡泰）」、同新学術領域研究「クロマチン機能を保証する核膜の構造と分子基盤（研究代表者：原口徳子）」、同新学術領域研究「細胞核・クロマチン構造のダイナミクスと遺伝子制御（研究代表者：木村宏）」、同新学術領域研究「再構成とエピゲノム編集による初期胚核の機能性獲得機序の理解（研究代表者：山縣一夫）」、同新学術領域研究「空間トランスオミクス技術の開発（研究代表者：大川恭行）」、同新学術領域研究「高転写状態獲得を理解するためのエピゲノム・トランスクリプトーム解析技術の開発（研究代表者：大川恭行）」、同新学術領域研究「高深度解析を可能とする単一細胞空間オミクス技術の開発（研究代表者：大川恭行）」、同新学術領域研究「ヘテロクロマチン構造形成の分子機構（研究代表者：中山潤一）」、同新学術領域研究「ヘテロクロマチンボディーの構築原理の解明（研究代表者：小布施力史）」、同基盤研究A（平岡泰、大川恭行）、同基盤研究B（大川恭行、原口徳子、小布施力史）、同萌芽研究（大川恭行）の一環として行われました。