FRET論文，Correlation of CheY-P concentration and motor behavior during attractant adaptation in single E. coli cells，がSciencesAdvancesに掲載されましたが，途中の計算がなかなかややこしいです．
そこで，日本語で順を追って説明していきたいと思います．
・Cross-Talk (CT)
クロストークなかなかややこしい概念ですが，式（２）には，
\(\Large \text{FRET ratio (%)} = \left( \frac{FI_{\mathrm{lac@YFP}}}{FI_{\mathrm{loc@CFP}} } - CT \right) \times 100 \hspace{40pt} (2)\)
と出てきます．論文では，CT = 0.34，としています．
この，0.34，はどこから出てきたのでしょうか？
Supplementary Materials，に詳しく書いてありますが，順を追って説明していきます．
基本は，筆頭著者の山越君の修士論文を参考にしています．
・ダイクロイックミラーセット
FRET蛍光顕微鏡には，
アクセプタ側のフィルター (Em1)
ドナー側のフィルター (Em2)
ダイクロイックミラー (DM3)
の３点セットがあり，使用する蛍光色素に応じて使用します．
ECFPの蛍光特性が，以下のような波長帯であれば，何も問題ありません．
しかし，実際は，
となり，CFPの蛍光が，CFP channelにも，YFP channelにも入り込むことがわかります (Fig.S1-B)．
つまり，”FRETが起きなくても（YFPが蛍光を発しなくても），YFP channelで蛍光が観測できちゃう”，ことになるのです．
この図からもわかるように，CFPの蛍光特性は幅広い波長帯に渡っており，YFPチャンネルにも存在することになります．
したがって，YFPチャンネルから，YFPの蛍光を計測しているが，その何割かがCFP由来であることになります．
その割合を検証するうえで，CFPの蛍光のYFPチャンネルのCFPチャンネルに対する割合を考えればよいことになります．
その分（これがクロストーク），をYFPチャンネルから差し引けば，YFP由来の蛍光をYFPチャンネルで定量することができます．
式で表すと，
\(\Large \frac{\displaystyle \int_{526}^{559} Em_{CFP} (\lambda) \ d \lambda }{\displaystyle \int_{463}^{501 } Em_{CFP} (\lambda) \ d \lambda} \)
この計算を行うためには，
ECFPの蛍光特性 (FPbase)
CFPチャンネルとYFPチャンネルを分離するダイクロイックミラー（DM3, FF509-FDi01, Semrock)
CFPチャンネルのフィルター（Em1, FF01-483/32, Semrock, 463-501)
YFPチャンネルのフィルター（Em2, FF01-542/27, Semrock, 526-559)
が必要となります．
この関係を図示したものが，
となり，
オレンジ ： CFPチャンネルのフィルター（Em1)
緑 ： YFPチャンネルのフィルター（Em2)
水色 ： CFPチャンネルとYFPチャンネルを分離するダイクロイックミラー（DM3)
紺 ： ECFPの蛍光特性
であり，赤い線が，CFP，YFPチャンネルそれぞれに透過するCFPの蛍光となります (Fig. S1-B)．
計算式は，
CFPチャンネルに透過するCFPの蛍光：CFPの蛍光 × CFPチャンネルフィルター特性 ×（１－ダイクロイックミラー特性）
YFPチャンネルに透過するCFPの蛍光：CFPの蛍光 × YFPチャンネルフィルター特性 × ダイクロイックミラー特性
その割合は， 0.337965....，となり，CT = 0.34，を導き出すことができます．
では，この値が妥当であるか，検証してきましょう．
