【回答】

 

★グループ5　　**************************************************************************

1：Multi-electrol-dish を用いて、100個の細胞の活動を同 時に計測する。

・In vivo 解析は複雑なネット ワークで記録や観察が難しいので、in vitro (culture) の系で解析する。

・Caイメージングや膜電 位感受性色素を用いて神経細胞の発火や伝導を光学的に経時的に二次元的に観察する。

・Activity-dependent な遺伝子発現制御を 観察(reporter assay を組み込みつつ)(ただし、遺伝子発現 はミリ秒オーダーでは変化しない)

・Pre-synaptic-marker (synaptophysin など) にGFPをつけたものとpost-synaptic-marker (PSD95 など) にRFP をつけたものを transgenic もしくは knock-in した動物をつくり、 その動物から取ってきた神経を培養して観察する、ライブで2色が対合したところ がsynapseと同定できる。

 

2：培養系はartifactである

→ しかし、組織を使う と細胞の数が増える

→ 元々神経細胞の少な い動物を使えばよい

→ C.elegance を使う。

 

★グループ6　　**************************************************************************

1. CCDカメラの時間分解能 を補うために、顕微鏡を複数用意する。

共焦点レーザー顕微鏡

 

2. MEMS(Micro Electro Mechanical Systems)で平面電極アレイを 作製。

⇒個々の電極に個々 の細胞を培養。

⇒培養して自己組織 化させる

⇒それぞれの電極か ら電気活動を計測

 

3. 計測したデータを利 用して、ニューロンの同期発火の全体のダイナミクスをシュミレーションする。

 

★グループ７　　**************************************************************************

【目 的】

単一ニューロンを様 々な刺激で興奮させ、その活動が小規模神経ネットワーク内ニューロン群の時空間的発火パタンにどのような影響を及ぼすかを調べ、単一ニューロン活動が神経 ネットワークによる情報コーディングに及ぼす影響を調べる。同時に、シナプスの可塑的変化を調べることによって情報コーディングの神経基盤の変化を明らか にする。

【方 法】

1.      ニュー ロン刺激

パッ チクランプによる電流注入

利 点

•  確 実に単一ニューロンのみを刺激できる
•  ス テップ刺激、サイン刺激など刺激のコントロールが容易

問 題点

•  技 術的に難しく、高いレベルでの習熟度が求められる

ケー ジドグルタメートを用いた局所刺激

利 点

•  技 術的には比較的容易

問 題点

•  単 一ニューロンのみを刺激できるか定かではない

2.      電 気活動の記録

第 ２高調波（SHG） 顕微鏡を用いたリアルタム計測

     利 点

•  観 察対象物質の分極の時間変化をシグナルとするため、細胞の膜電位変化を直接可視化することができる。（Ca²⁺イ メージングに対する優位性）
•  高 時間解像度（サブミリ秒）、高空間解像度（500nm〜）
• 任 意の神経細胞の活動を記録することが可能（？）

問 題点

•  神 経細胞活動の同時記録に耐えうるSN比 が確保できるかどうか未知

多 点基板電極を 用いた細胞外活動の同時記録

     利 点

•  す でに確立された手法

問 題点

•  電 極の配置が固定されているので、すべての細胞活動を記録することは困難

 

SHG顕 微鏡と多点基板電極を組み合わせることによってお互いの欠点を補うことが出来る

3.      シ ナプスの可塑的変化の可視化（できたらいいな）

目 的：神経ネットワーク可塑的変化の基盤であるシナプス可塑性をリアルタイムで観察する。

 

方 法：神経伝達物質が受容されると蛍光を発する蛍光物質を受容体に発現させ、神経ネットワークの活動度に依存したシナプスの活動（神経伝達物質の放出、受 容）の変化を調べる。

 

具 体的方法はわからない。。。

 

 

★グループ12　　*************************************************************************

背景 (現在までに確立され ている手法)

・剣山電極による活 動電位の測定

→問題 ： 1個の細胞あたり1個の剣山の上で培養 できるとは限らない

・細胞内Ca濃度の変化をCaの指示薬(濃度によって蛍光強 度が変わる)でScan

→問題点：サブミリ 秒単位でのScanは不可能(Caレスポンスが遅いた め)

 

戦略

10個程度の細胞単位に おいてコンタクトしている細胞をみる

→まず、細胞のコン タクトにおいてシミュレーションを組む

→電位感受性色素で 実験を行い、活動電位のシミュレーションを行うのに必要な情報を得る

→コンピューターシ ミュレーションで100個単位の系に膨らま せる

 

実験手法

�@細胞にウイルスベ クターで光感受性プロトンポンプの動作をコントロールするタンパクを発現するコンストラクトを感染させる→培養系

�A形態的にどのよう な回路をつくるのか。10個程度のレベルで組 み合わせて調べる

→100個ではどうなるのか コンピューターでのシミュレーション構築

�B電位感受性色素 (これは培地に入れる と細胞膜に結合する) で標識

�C光刺激で活動刺激 を生じさせる

→1個の場合、2個の場合・・・

�D活動電位の生じた 連絡を調べる

�E�Aで作製したネッ トワークシミュレーションに組み入れる

�Fさらに実際に�B―�Dを行い構築したコ ンピューター上のシミュレーションが実際の挙動を合致しているか確認する

 

【回答】

 

★グループ5　　**************************************************************************

1：Multi-electrol-dish を用いて、100個の細胞の活動を同 時に計測する。

・In vivo 解析は複雑なネット ワークで記録や観察が難しいので、in vitro (culture) の系で解析する。

・Caイメージングや膜電 位感受性色素を用いて神経細胞の発火や伝導を光学的に経時的に二次元的に観察する。

・Activity-dependent な遺伝子発現制御を 観察(reporter assay を組み込みつつ)(ただし、遺伝子発現 はミリ秒オーダーでは変化しない)

・Pre-synaptic-marker (synaptophysin など) にGFPをつけたものとpost-synaptic-marker (PSD95 など) にRFP をつけたものを transgenic もしくは knock-in した動物をつくり、 その動物から取ってきた神経を培養して観察する、ライブで2色が対合したところ がsynapseと同定できる。

 

2：培養系はartifactである

→ しかし、組織を使う と細胞の数が増える

→ 元々神経細胞の少な い動物を使えばよい

→ C.elegance を使う。

 

★グループ6　　**************************************************************************

1. CCDカメラの時間分解能 を補うために、顕微鏡を複数用意する。

共焦点レーザー顕微鏡

 

2. MEMS(Micro Electro Mechanical Systems)で平面電極アレイを 作製。

⇒個々の電極に個々 の細胞を培養。

⇒培養して自己組織 化させる

⇒それぞれの電極か ら電気活動を計測

 

3. 計測したデータを利 用して、ニューロンの同期発火の全体のダイナミクスをシュミレーションする。

 

★グループ７　　**************************************************************************

【目 的】

単一ニューロンを様 々な刺激で興奮させ、その活動が小規模神経ネットワーク内ニューロン群の時空間的発火パタンにどのような影響を及ぼすかを調べ、単一ニューロン活動が神経 ネットワークによる情報コーディングに及ぼす影響を調べる。同時に、シナプスの可塑的変化を調べることによって情報コーディングの神経基盤の変化を明らか にする。

【方 法】

1.      ニュー ロン刺激

パッ チクランプによる電流注入

利 点

•  確 実に単一ニューロンのみを刺激できる
•  ス テップ刺激、サイン刺激など刺激のコントロールが容易

問 題点

•  技 術的に難しく、高いレベルでの習熟度が求められる

ケー ジドグルタメートを用いた局所刺激

利 点

•  技 術的には比較的容易

問 題点

•  単 一ニューロンのみを刺激できるか定かではない

2.      電 気活動の記録

第 ２高調波（SHG） 顕微鏡を用いたリアルタム計測

     利 点

•  観 察対象物質の分極の時間変化をシグナルとするため、細胞の膜電位変化を直接可視化することができる。（Ca²⁺イ メージングに対する優位性）
•  高 時間解像度（サブミリ秒）、高空間解像度（500nm〜）
• 任 意の神経細胞の活動を記録することが可能（？）

問 題点

•  神 経細胞活動の同時記録に耐えうるSN比 が確保できるかどうか未知

多 点基板電極を 用いた細胞外活動の同時記録

     利 点

•  す でに確立された手法

問 題点

•  電 極の配置が固定されているので、すべての細胞活動を記録することは困難

 

SHG顕 微鏡と多点基板電極を組み合わせることによってお互いの欠点を補うことが出来る

3.      シ ナプスの可塑的変化の可視化（できたらいいな）

目 的：神経ネットワーク可塑的変化の基盤であるシナプス可塑性をリアルタイムで観察する。

 

方 法：神経伝達物質が受容されると蛍光を発する蛍光物質を受容体に発現させ、神経ネットワークの活動度に依存したシナプスの活動（神経伝達物質の放出、受 容）の変化を調べる。

 

具 体的方法はわからない。。。

 

 

★グループ12　　*************************************************************************

背景 (現在までに確立され ている手法)

・剣山電極による活 動電位の測定

→問題 ： 1個の細胞あたり1個の剣山の上で培養 できるとは限らない

・細胞内Ca濃度の変化をCaの指示薬(濃度によって蛍光強 度が変わる)でScan

→問題点：サブミリ 秒単位でのScanは不可能(Caレスポンスが遅いた め)

 

戦略

10個程度の細胞単位に おいてコンタクトしている細胞をみる

→まず、細胞のコン タクトにおいてシミュレーションを組む

→電位感受性色素で 実験を行い、活動電位のシミュレーションを行うのに必要な情報を得る

→コンピューターシ ミュレーションで100個単位の系に膨らま せる

 

実験手法

�@細胞にウイルスベ クターで光感受性プロトンポンプの動作をコントロールするタンパクを発現するコンストラクトを感染させる→培養系

�A形態的にどのよう な回路をつくるのか。10個程度のレベルで組 み合わせて調べる

→100個ではどうなるのか コンピューターでのシミュレーション構築

�B電位感受性色素 (これは培地に入れる と細胞膜に結合する) で標識

�C光刺激で活動刺激 を生じさせる

→1個の場合、2個の場合・・・

�D活動電位の生じた 連絡を調べる

�E�Aで作製したネッ トワークシミュレーションに組み入れる

�Fさらに実際に�B―�Dを行い構築したコ ンピューター上のシミュレーションが実際の挙動を合致しているか確認する